近日，Chinese Medical Journal 杂志在线发表了艾米森与北京大学第一医院李学松教授团队合作发表的名为“An accurate diagnostic approach for urothelial carcinomas based on novel dual methylated DNA markers in small-volume urine”的文章，介绍了一种基于不到2毫升尿液的以新型双靶标为检测靶点，可同时检测膀胱癌、肾盂癌和输尿管癌这三种尿路上皮癌的新技术。

当前尿路上皮癌的诊断方法大多是有创的或者准确性不高，尿液中脱落细胞DNA或者cfDNA 在尿路上皮癌诊断中表现出巨大的潜力。尿路上皮癌包括下尿路上皮癌（主要是膀胱癌）和上尿路上皮癌（包括肾盂癌和输尿管癌）。当前尿液DNA甲基化诊断标记物绝大多数是针对膀胱癌，尿路上皮癌的通用标记物很少。另外，现有的尿液DNA甲基化检测技术大多基于大体积尿液（数十毫升）。本项目在前期研发过程中发现了一个全新的尿路上皮癌通用标记物AL021918.2， 并将其与VIM组成了双靶标Panel，在基于1.8mL的检测体系中，该Panel对尿路上皮癌的检测敏感性和特异性均在90%以上。

该研究使用窗口滑动算法分析TCGA数据库里的膀胱癌组织样本和癌旁组织样本之间的差异甲基化区域（differentially methylated regions (DMRs)），用ROC曲线分析每个DMR的甲基化水平对TCGA中膀胱癌和癌旁样本的区分能力，根据两个标准筛选Top DMR，标准1为：特异性大于95%，敏感性排名前20；标准2为：特异性大于90%，敏感性排名前5。

其次，从25个标记物中选取8个在30例健康血细胞样本和20例健康人尿液样本中进行Sanger 测序，剔除在10%以上的健康样本中出现甲基化位点的DMR，将剩余DMR在47例膀胱癌组织，14例输尿管癌及其配对的癌旁组织和14例肾盂癌及其配对的癌旁组织中进行甲基化特异性PCR验证，最终确定了敏感性和特异性最优的甲基化标记物—AL021918.2（下图1）。

图1.各个标记物在组织样本中的甲基化特异性PCR结果分析

其中NAT表示癌旁正常组织，LG-UTUC表示低级别上尿路上皮癌，HG-UTUC表示高级别上尿路上皮癌，LG-BCa表示低级别膀胱癌，HG-BCa表示高级别膀胱癌。

最后，将AL021918.2和其他甲基化标记物在477例尿液样本中进行甲基化特异性PCR验证，尿液样本包括199例膀胱癌、39例肾盂癌、26例输尿管癌和213例阴性/干扰样本（良性疾病样本、良性肿瘤样本和其他泌尿系癌症样本）。PCR分析结果如下图2所示。在所有样本中单独分析一个标记物时，AL021918.2的ROC曲线下面积值（AUC值）、敏感性和特异性均最高，分别为0.94、87.12%和93.90%；当两个标记物组合时，AL021918.2和VIM的组合检测准确性最高，AUC值、敏感性和特异性分别为0.96、93.94%和92.02%。另外，两个基因组合对低级别膀胱癌、低级别上尿路上皮癌、Ta期尿路上皮癌的敏感性均在90%以上，分别为91.11%、100%和94.44%。

图2. 尿液甲基化特异性PCR检测结果分析

其中M25代表AL021918.2；PUNLMP表示低度恶性潜能乳头状瘤；LG表示低级别；HG表示高级别；KIRP表示肾乳头状细胞癌；KIRC表示肾透明细胞癌。

AL021918.2与VIM的组合可达到超过90%的整体准确度。我们的诊断标记物的总体特异性为92.02%，与细胞学检查特异性相当，其对低级别和早期癌的敏感性也都高于90%。最重要的是，该标记物组合在诊断上尿路上皮癌方面表现优异，而上尿路上皮癌易被传统的细胞学和荧光原位杂交漏检。

上述优点将有助于医务人员在多种临床场景下做出决策。例如，该诊断工具可用于血尿人群的风险分层，从而可以减少内镜检查的工作量。此外，将这样准确的非侵入性方法与影像学方法结合使用时，可以帮助确认或排除有无上尿路上皮癌的存在。此外，该分子尿液检测阳性后，再使用更敏感的窄带成像或光动力学做确诊，可以降低传统白光镜带来的假阴性。因此，这种简单有效的诊断检测方法具有广阔的临床应用前景。